La neurotrasmissione glutammatergica 5/ Eccitotossicità nella patogenesi della SLA

Cosa unisce la neurotrasmissione glutammatergica con la SLA? Se desiderate scoprirlo, mettetevi comodi, armatevi di pazienza e seguitemi attentamente. La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), o morbo di Lou Gehrig (dal nome di un famoso giocatore di baseball statunitense, la prima vittima accertata di questa patologia), è una malattia rara (1-2 casi ogni 100 mila individui all’anno) che si sviluppa tra i 50 e i 60 anni di età e che è caratterizzata da perdita della capacità di deglutizione (disfagia), dell’articolazione della parola (disartria) e paralisi progressiva che conduce alla morte in 3-5 anni, spesso per crisi respiratoria.

Diverse mutazioni geniche sono state attribuite alla SLA. Quelle più studiate riguardano il gene che produce la superossido dismutasi Cu/Zn (SOD1), il primo ad essere stato individuato come gene mutato nella SLA. Alcune mutazioni riducono l’attività dismutasica (ad esempio A4V e G85R), altre la mantengono (G37R e G93A) o addirittura aggiungono funzioni tossiche per le cellule. In circa il 20% di casi di SLA familiare è presente una mutazione nel gene per SOD1 (La SLA familiare per la mutazione di SOD1 è la più frequente, tanto da essere talvolta considerata come modello general di SLA).

L’enzima SOD1 appartiene alla classe delle ossidoreduttasi ed è un importante antiossidante in quanto catalizza la reazione di dismutazione dell’anione superossido (O₂^-), un radicale libero prodotto dal metabolismo aerobico capace di danneggiare le cellule, in O₂ e perossido di idrogeno (H₂O₂). L’anione superossido è il prodotto dell’incompleta riduzione dell’ossigeno molecolare durante la fosforilazione ossidativa. Le forme mutate di SOD1 sono in grado di catalizzare reazioni ossidative aberranti, come ad esempio reazioni di perossidazione, in cui l’H₂O₂ prodotto dalla reazione di dismutazione dello stesso enzima viene (ri)convertito in anione superossido oppure in radicali idrossilici (OH^.), mediante reazione di Fenton. L’anione superossido può a sua volta reagire con il monossido di azoto (NO) – prodotto dell’enzima NOS – e formare il perossinitrito (ONOO^-), il quale può essere utilizzato dallo stesso SOD1 per causare la nitrazione delle proteine a carico dei residui di Tirosina (3-nitrotirosina).

Studi recenti hanno evidenziato che i motoneuroni sono fortemente vulnerabili quando sono esposti ad elevati livelli extrasinaptici di glutammato. L’esposizione cronica ad un ipertono glutammatergico da parte dei motoneuroni sembra avere un ruolo chiave nella neurodegenerazione progressiva di tipo eccitotossico che si osserva nei casi di SLA.  La patogenesi della Sclerosi Laterale Amiotrofica è multifattoriale e ciò rende difficile la comprensione della sua eziologia. La morte dei motoneuroni è infatti il risultato della combinazione di diversi meccanismi molecolari, non solo stress ossidativo ed eccitotossicità, ma anche disfunzione mitocondriale, aggregazione proteica, disfunzione citoscheletrica, difetti nella maturazione dell’RNA. Inoltre, non è chiaro ancora quali tra questi fattori siano le cause primarie della malattia e quali invece siano le conseguenze.

Purtroppo ancora oggi non esiste alcuna cura definitiva della SLA. L’unico farmaco approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) è il riluzolo, un benzotiazolo che riduce il rilascio di glutammato mediante il blocco dei canali del sodio voltaggio-dipendenti. Il riluzolo tuttavia prolunga l’aspettativa di sopravvivenza fino a soli tre mesi.

Ma torniamo ai motoneuroni: la loro risposta all’esposizione prolungata al glutammato o a neurotossine è l’attivazione di fenomeni di tipo eccitotossico cui segue un’anomala produzione a livello mitocondriale di specie reattive dell’ossigeno (i cosiddetti ROS). Lo stress ossidativo sorge quando la produzione dei ROS supera la sua stessa rimozione da parte dei sistemi antiossidanti che inattivano i ROS e riparano i danni causati alle molecole biologiche. In particolare, i perossinitriti ed i radicali ossidrilici sono potenti agenti ossidanti, capaci di danneggiare proteine, lipidi e DNA. Nei casi di SLA si osservano elevati livelli di carbonilazione proteica sia a livello spinale che corticale, oltre ad aumentati livelli di nitrazione dei residui di tirosina in 3-nitrotirosina, biomarcatori del danno mediato da perossinitriti. Come se non bastasse, gli agenti ossidanti non solo danneggiano le stesse cellule che li producono, ma attraversando la membrana plasmatica raggiungono gli astrociti immediatamente adiacenti, dove inducono danni di tipo ossidativo. Uno dei bersagli dei ROS è stato visto essere EAAT2 (neurotrasportatore gliale per il glutammato, insieme a EAAT1) la cui distruzione comporta aumento dell’ipertono glutammatergico nello spazio sinaptico, perché viene a mancare un importante sistema di buffer del glutammato che in condizioni fisiologiche regola la durata della trasmissione glutammatergica. A questo evento consegue l’inasprimento dei fenomeni di eccitotossità a livello dei motoneuroni ed ulteriore stress ossidativo. In questo modo si verrebbe a creare un circolo vizioso che potrebbe essere alla base della progressione della malattia. La perdita del trasportatore EAAT2 non è comunque generalizzata, ma riguarda soltanto le popolazioni astrocitarie del midollo spinale e della corteccia motoria che sono coinvolte nella malattia.

La spiccata sensibilità dei motoneuroni verso il glutammato pare possa essere attribuita, specificamente nella Sclerosi Laterale Amiotrofica familiare associata alla defezione di SOD1, all’abbondante presenza di particolari recettori AMPA privi di subunità GluR2, ad elevata conduttanza per il Ca²⁺. Studi sperimentali hanno infatti dimostrato la partecipazione dei recettori AMPA nella patogenesi della SLA anziché dei recettori NMDA, poiché si è visto che la degenerazione dei motoneuroni, indotta da inibitori dei neurotrasportatori gliali per il glutammato, viene bloccata soltanto in presenza di antagonisti dei recettori AMPA. Inoltre, la maggior parte dei motoneuroni sembra essere dotata di un debole sistema di buffer del Ca²⁺ citosolico (a causa della ridotta espressione delle proteine chelanti il Ca²⁺), che non è in grado pertanto di regolare efficientemente l’omeostasi intracellulare del calcio in presenza di una forte esposizione al glutammato.

Lo stress ossidativo innescato dall’interazione del glutammato coi recettori AMPA privi di GluR2 richiede l’influsso di calcio nei motoneuroni ed è inibito da bloccanti della catena di trasporto degli elettroni, suggerendone l’origine mitocondriale. L’ingresso di calcio nei motoneuroni causa la produzione a livello mitocondriale dei ROS, come è stato dimostrato attraverso misurazioni compiute utilizzando l’indicatore fluorescente idroetidina (HEt), che è sensibile alle specie ossidanti, in colture di neuroni spinali trattate con kainato. L’idroetidina viene ossidata in etidio e fluoresce quando si intercala nel DNA. L’origine mitocondriale dei ROS è stata inoltre dimostrata mediante trattamento con rotenone, inibitore della catena di trasporto degli elettroni. L’aggiunta di rotenone riduce la produzione di ROS, quindi il livello di fluorescenza di HEt. Le specie reattive dell’ossigeno, prodotte in grande quantità all’interno dei motoneuroni, attraversano la membrana plasmatica, si disperdono nell’ambiente extracellulare e attaccano le adiacenti popolazioni astrocitarie. Il trattamento delle cellule in coltura con un agente antiossidante extracellulare (per esempio SOD) previene l’ossidazione, dunque il danneggiamento, degli astrociti. L’etidio, essendo una molecola carica, non è in grado di attraversare la membrana plasmatica; questo, insieme al fatto che l’aggiunta di SOD in coltura blocca la propagazione dello stress ossidativo, rende ragione del fatto che i ROS, una volta prodotti, diffondono nello spazio extracellulare.

Nel contesto dei fenomeni eccitotossici, che nell’ambito della Sclerosi Laterale Amiotrofica portano alla generazione di specie ossidanti da parte dei motoneuroni spinali e corticali e alla rapida distruzione dei neurotrasportatori gliali, meritano considerazione anche altri fattori correlati che contribuiscono allo sviluppo della malattia. Per esempio un’altra risposta eccitotossica è l’attivazione della via di morte cellulare di tipo apoptotico, guidata dai mitocondri tramite riversamento di citocromo c nell’ambiente citosolico ed attivazione di altre proteine proapoptotiche. A ciò si aggiunge l’accumulo intracellulare di aggregati proteici, probabile conseguenza dello stress ossidativo. I diversi fattori causali della SLA, ossia mutazione del gene SOD1, esposizione a neurotossine e processi infiammatori associati ad attivazione della microglia, potrebbero dunque trovare un punto di convergenza nei meccanismi di progressione della malattia, i quali con un processo a feedforward danno origine ad un vero e proprio circolo vizioso che si autoalimenta.

Da uno studio del 2010, pubblicato su Neuropathology, sono emerse ulteriori evidenze sulla partecipazione dei recettori AMPA nella patogenesi della SLA sporadica. In alcuni casi di SLA sporadica sono state individuate le tipiche mutazioni causative della malattia a carico del gene per SOD1. Tuttavia, nella maggior parte dei casi di malattia sporadica non è stata riconosciuta alcuna delle mutazioni genetiche che contraddistinguono le differenti forme di Sclerosi Laterale Amiotrofica familiare. Questo aspetto ha fatto ritenere possibile l’esistenza di differenti meccanismi patogenetici alla base della degenerazione dei motoneuroni tipica della SLA in generale. Tra le diverse ipotesi che sono state proposte dalla comunità scientifica, al fine di comprendere l’eziologia della SLA sporadica, ha ricevuto particolare considerazione il ruolo dei recettori AMPA, che di fatto mantiene un filo conduttore tra la SLA familiare e la SLA sporadica, sebbene con meccanismi molecolari differenti.

Nella SLA sporadica,  la degenerazione dei motoneuroni spinali e corticali si realizza attraverso i fenomeni di eccitotossicità e stress ossidativo discussi sopra. Tuttavia, la vulnerabilità dei motoneuroni alle neurotossine agoniste dei recettori AMPA non dipende dall’assenza delle subunità GluR2 nella costituzione dei recettori, bensì è dovuta al fatto che viene a mancare il processo di editing dell’mRNA che converte l’Adenosina nel nucleotide Inosina in corrispondenza del sito Q/R del territorio M2 di questa subunità. L’editing dell’mRNA fa sì che il codone CAG, codificante per una glutammina (Q), venga sostituito con il codone CIG (equivalente a CGG), codificante per un aminoacido arginina. Il recettore AMPA contenente una subunità GluR2, in cui è avvenuto l’editing dell’mRNA, è impermeabile al calcio grazie alla carica positiva del residuo di arginina. Quasi tutte le cellule nervose in condizioni fisiologiche, compresi i motoneuroni interessati nella patogenesi della SLA, normalmente contengono nella loro costituzione subunità GluR2 correttamente editate (denominate GluR2R).  In condizioni patologiche, invece, come nel caso della Sclerosi Laterale Amiotrofica sporadica, il meccanismo di editing sul sito Q/R delle subunità GluR2 risulta essere meno efficiente, pertanto cresce la quantità di recettori AMPA che nel sito Q/R mantiene la glutammina e pertanto tali recettori divengono permeabili al Ca²⁺ (GluR2Q).

Quindi, a differenza della SLA familiare (in cui si osservava una ridotta espressione di GluR2 già a livello genico e il GluR2 presente era correttamente editato) nella SLA sporadica le subunità GluR2 sono espresse, ma in corrispondenza del sito Q/R portano una glutammina (GluR2Q), anziché una arginina (GluR2R).

Gli enzimi responsabili della conversione di Adenosina in Inosina (A-to-I conversion) sono deaminasi chiamate ADAR (acronimo di Adenosine Deaminases Acting on RNA) e nei mammiferi ne sono stati individuati tre (ADAR1, ADAR2 e ADAR3). In particolare, ADAR2 riconosce nel pre-mRNA di GluR2 una struttura a dsRNA (costituita dall’esone 11 contenente il residuo di Adenosina da editare e da una sequenza intronica) in cui catalizza la reazione di deaminazione.

Nella SLA sporadica, la carenza di subunità GluR2R pare possa essere causata dalla inefficiente attività dell’enzima ADAR2. La deficienza di ADAR2 è infatti causa di  crisi epilettiche e di morte dei motoneuroni, come è stato possibile osservare in topi knock-out condizionali. In particolare, nei casi di SLA sporadica si osservano ridotti livelli di espressione dell’mRNA di ADAR2 nelle corna ventrali del midollo spinale, rispetto ai controlli.

Per concludere, vi presento brevemente uno studio tutto italiano del 2011, pubblicato su Neurobiology of Disease e concernente l’azione neuroprotettiva di un farmaco antagonista dei recettori metabotropici mGlu5. Si tratta di una ricerca molto interessante i cui risultati potrebbero promettere lo sviluppo di una nuova strategia terapeutica contro la SLA.

Nella terza parte ho discusso sui recettori metabotropici. Lì forse non ho detto che, per ragioni ancora da chiarire, i recettori metabotropici per il glutammato accoppiati a proteine Gq, in particolare mGlu5, si rivelano particolarmente abbondanti nelle popolazioni di astrociti e microglia dei tessuti nervosi spinali interessati da fenomeni di eccitotossicità, sia nei casi sporadici sia in quelli familiari di Sclerosi Laterale Amiotrofica. L’attivazione farmacologica degli stessi recettori in colture miste di neuroni e astrociti, secondo studi recenti, amplifica l’eccitotossicità del sistema, favorendo il processo di degenerazione lenta dei motoneuroni.

Ora, secondo il suddetto studio, si è visto che nei casi sperimentali di SLA familiare un antagonista dei recettori mGlu5, il 2-metil-6-(feniletinil)-piridina, meglio noto con la sigla MPEP, svolge un’azione protettiva nei confronti dei motoneuroni spinali cresciuti in colture arricchite da astrociti, opportunamente attivati. In particolare, il blocco prolungato di mGlu5 prima dell’evento eccitotossico mediato da AMPA, anziché durante o dopo, riduce significativamente la degenerazione dei motoneuroni. L’antagonista MPEP riuscirebbe infatti a ridurre indirettamente la conduttanza al Ca²⁺ da parte dei recettori AMPA (privi di subunità GluR2) espressi sui motoneuroni (anziché sugli astrociti), e consentirebbe di salvare le cellule dalla morte per eccitotossicità indotta da AMPA.

Il blocco di mGlu5 a livello astrocitario tramite MPEP comporta la riduzione dell’espressione del fattore neurotrofico cerebrale BDNF (acronimo di Bran-Derived Nurotrophic Factor) unitamente alla riduzione dell’espressione di GluR1 da parte dei motoneuroni. BDNF è un fattore di crescita stimolato dall’attivazione dei recettori mGlu5 astrocitari. Esso, legandosi a TrkB (un recettore ad attività tirosin-chinasica intrinseca) ha un duplice effetto sui motoneuroni: a livello basale è un fattore di sopravvivenza, mentre ad alte concentrazioni aumenta la sensibilità dei motoneuroni al glutammato e all’AMPA, probabilmente incrementando l’espressione della subunità recettoriale GluR1, che conferisce ai recettori AMPA maggiore permeabilità al Ca²⁺.

Il ruolo degli astrociti è stato definitivamente chiarito tramite l’utilizzo del fattore solubile AraC, che blocca la loro crescita. I risultati evidenziano che nelle colture miste trattate con AraC la percentuale di motoneuroni è maggiore rispetto a quella misurata nelle colture non trattate con questo fattore, ciò dimostra che in queste condizioni sperimentali gli astrociti sono fattori di rischio per i motoneuroni. Inoltre, a bassi livelli di astrociti il farmaco MPEP perde di efficacia nella protezione dei motoneuroni esposti ad AMPA. Queste evidenze dimostrano quindi che (1) il BDNF è espresso principalmente a livello astrocitario, in risposta all’attivazione dei recettori mGlu5 e (2) che l’efficacia farmacologica di MPEP è mediata dagli astrociti.

Spero che l’argomento sia stato di vostro interesse. Ringrazio di cuore tutti coloro che hanno avuto la pazienza di seguirmi in questa lunga dissertazione e mi scuso per non essere stato sempre puntuale nelle pubblicazioni. Alla prossima!