gen 5, 2012 · · Biochimica, InbioSpiega, Serie

La vitamina del sole – parte seconda


La carenza di vitamina D è la principale causa di rachitismo

Nella prima parte abbiamo visto che la sintesi della forma biologicamente attiva della vitamina D, il calcitriolo, si realizza nell’organismo a partire dalla fotolisi del 7-deidrocolesterolo e prosegue con due reazioni di idrossilazione, nelle posizioni 1 e 25, catalizzate dalle monoossigenasi della famiglia del citocromo P450.

La vitamina D in realtà non è una vitamina. La vitamina D è un ormone. Essa infatti non è, come le vitamine, un cofattore enzimatico o un antiossidante, ma circola nell’organismo ed influenza la funzione di vari tipi di cellule e di tessuti bersaglio agendo secondo le caratteristiche degli ormoni steroidei: essendo di natura lipidica, entra nella cellula attraversando la membrana plasmatica e si lega ad un recettore nucleare specifico, chiamato VDR (acronimo di Vitamin D Receptor), che modula l’espressione genica delle cellule target.  Trattandosi di un fattore di trascrizione, il VDR possiede vicino l’N-terminale un dominio di legame al DNA (DBD, da DNA-Binding Domain) altamente conservato: contiene due motivi a dita di zinco (zinc finger) di tipo C2C2, dove ciascuno zinco è coordinato con quattro cisteine. Il motivo a dita di zinco è comune nelle proteine che legano il DNA, dove di solito si trova ripetuto in tandem.

E’ costituito da un’ansa di circa 23 aminoacidi che coordina uno ione Zn2+ mediante una struttura tetraedrica conservata, formata da residui His (istidina) e Cys (cisteina). Tuttavia, nel dominio di legame al DNA dei recettori degli steroidi la sequenza consenso di un motivo a dita di zinco presenta aminoacidi Cys ma non His:

Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys

dove le X rappresentano aminoacidi variabili. Il DBD del VDR contiene due dita consecutive che possono legarsi al DNA come omodimeri o eterodimeri mediante l’interazione di una porzione aminoacidica del primo dito, detta P box, con una sequenza di riconoscimento specifica sul DNA. Il D box sul secondo dito è importante per la dimerizzazione e per il contatto con lo scheletro di zucchero e fosfato del DNA.

Schema del doppio motivo a dita di zinco C2C2, caratteristico del DBD dei recettori per gli ormoni steroidei

2. Schema del doppio motivo a dita di zinco C2C2, caratteristico del DBD dei recettori per gli ormoni steroidei

A monte del DBD vi è un dominio di attivazione della trascrizione, detto AF1, in grado di legare i coattivatori della trascrizione (enzimi che modulano positivamente la trascrizione, come l’istone acetilasi, la cui azione promuove lo svolgimento della cromatina). A valle rispetto DBD, spostandoci verso la porzione C-terminale del recettore, troviamo prima una cerniera (zona hinge) che collega il DBD con un dominio di traslocazione nucleare (NLS, da Nuclear Localization Signal) poi un dominio di dimerizzazione (DD, da Dimerization Domain), un dominio di legame della vitamina D (LBD, da Ligand-Binding Domain) e, poco più a monte dell’estremità carbossi-terminale, un secondo dominio di attivazione AF2, che può legare sia coattivatori che corepressori della trascrizione in maniera ligando-dipendente.

Come molti altri recettori nucleari, anche il VDR eterodimerizza, dopo aver legato la vitamina D, mediante l’interazione con il recettore dell’acido 9-cis retinico (RXR). Il complesso vitamina D-VDR-RXR si lega a una regione specifica del DNA, un sito di riconoscimento sul promotore di un gene bersaglio, chiamato elemento di risposta alla vitamina D o VDRE (Vitamin D Response Element). Il VDRE è costituito da una sequenza consenso –  PuG(G/T)TCA –  ripetuta in tandem due volte e si può trovare o come ripetizione diretta (tipo DR3) o come palindromo invertito (tipo ER6). L’elemento di risposta è quindi formato da due emisiti, separati da un certo numero di basi (sequenza spaziatrice). Ciascun monomero entra in contatto con un solo emisito.

Rappresentazione schematica della struttura primaria del VDR, dell’eterodimero VDR-RXR e del VDRE, nelle forme DR3 e ER6.

3. Rappresentazione schematica della struttura primaria del VDR, dell’eterodimero VDR-RXR e del VDRE, nelle forme DR3 e ER6.

La vitamina D può controllare la trascrizione dei geni target mediante l’attivazione del VDR che, in presenza del ligando, può legarsi al DNA ed interagire con altre proteine. In particolare, al complesso vitamina D-VDR-RXR si associano proteine accessorie dette coregolatori, la cui funzione consiste nel facilitare (coattivatori) o nel bloccare (corepressori) il legame con il complesso di inizio della trascrizione. Il VDR eterodimerizzato può infatti assumere due diverse conformazioni, che a livello del dominio AF2 permettono l’esposizione di un sito di legame o per il corepressore o per il coattivatore e quindi la vitamina D sarà in grado di inibire o attivare la trascrizione.

La volta scorsa non vi ho detto che l’attività dell’enzima CYP27B1, quindi la sintesi di calcitriolo, è stimolata dal paratormone (PTH) e da bassi livelli sierici di ioni calcio. D’altra parte, la stessa vitamina D controlla la sintesi del paratormone agendo direttamente nelle ghiandole paratiroidi. La funzione classica della vitamina D, insieme al paratormone, è infatti quella di regolare la concentrazione di calcio nel sangue e nei fluidi interstiziali. Non a caso il VDR è stato individuato su organi coinvolti nel metabolismo del Ca2+ quali intestino, rene, osso e paratiroidi.

Regolazione del calcio nel corpo umano

4. Regolazione del calcio nel corpo umano

Il calcio (Ca2+) partecipa in funzioni biologiche molto importanti come l’esocitosi, la contrazione muscolare, la neurotrasmissione e la coagulazione. I livelli di calcio intra- ed extracellulari, oltre a quelli ematici, devono comunque essere mantenuti entro valori omeostatici, onde evitare l’attivazione di risposte cellulari diciamo “indesiderate”: basti pensare che il calcio in eccesso attiva enzimi del metabolismo degradativo come proteasi, endonucleasi e fosfolipasi, oltre ad inasprire lo stress ossidativo mediato da specie reattive dell’ossigeno (ROS). La risultante degli effetti è la morte cellulare per necrosi, una forma di morte dannosa per l’organismo perché provoca il rilascio del contenuto della cellula necrotica nello spazio circostante ed è perciò causa di infiammazione con danneggiamento degli organi. Nelle cellule, l’omeostasi del calcio è garantita da pompe che estrudono Ca2+ contro gradiente elettrochimico – consumando energia che ricavano da ATP – all’interno dei reticoli endoplastici (anche detti calciosomi), trasportatori che traslocano il calcio citosolico nell’interstizio scambiandolo con altri ioni – generalmente sodio (Na+) – e proteine, come la calmodulina, che legano il calcio libero nel citosol, funzionando da sistemi tampone.

Allo stesso modo, nel plasma la concentrazione di calcio (calcemia) non deve superare una certa soglia (10 mg/100 mL nell’individuo adulto): l’eccesso (ipercalcemia) può provocare ad esempio danni al cuore e al sistema nervoso. La quantità di calcio presente nei fluidi interstiziali e nel plasma dipende fondamentalmente dall’assorbimento a livello dell’intestino tenue, dal riassorbimento a livello dei tubuli renali e dalla demineralizzazione ossea. Questi processi sono sotto il controllo del sistema endocrino, rappresentato dalla vitamina D, dal paratormone e dalla calcitonina – questi ultimi due sono ormoni polipeptidici – e sono finalizzati al mantenimento dell’omeostasi del calcio. Il paratormone (PTH) è sintetizzato e secreto dalle paratiroidi in risposta a bassi livelli di calcio plasmatico (ipocalcemia) e media una azione ipercalcemizzante, mentre la calcitonina è prodotta dalle cellule C parafollicolari della tiroide in risposta all’ipercalcemia e media una azione ipocalcemizzante (eliminazione di calcio con le urine e deposizione nelle ossa).

Esiste una connessione funzionale tra vitamina D e PTH.  Dicevo che il paratormone stimola l’attivazione di CYP27B1.  La vitamina D, infatti, opera, come e con il paratormone, al fine di incrementare i livelli ematici di calcio. E’ inoltre in grado di controllare la sua sintesi inibendo il rilascio di PTH una volta che i livelli di calcio raggiungono valori omeostatici. La vitamina D promuove l’assorbimento intestinale e riduce la perdita di calcio con le urine. Sia negli enterociti che nelle cellule renali degli epiteli di rivestimento, rispettivamente del lume intestinale e del lume del tubulo contorto prossimale, la vitamina D stimola, agendo a livello genomico, la produzione di calbindina (CaBP), una proteina che, come la calmodulina (CaM), lega ad alta affinità il calcio riversato nel citosol mediante trasportatori dei microvilli della membrana apicale (un esempio è TRPV6, originariamente chiamato CaT1, principalmente espresso a livello intestinale e anch’esso sotto il controllo trascrizionale da parte della vitamina D). La calbindina presenta il calcio alle pompe Ca2+-ATPasi della membrana basolaterale, che trasportano attivamente lo ione nello spazio interstiziale. Da qui poi il calcio entra nel sangue. La calbindina fa sì che il calcio passi in maggiori quantità da un capo all’altro della cellula, senza che aumenti la sua concentrazione libera citosolica; in questo senso, la calbindina, essendo un chelante del calcio, si comporta da sistema tampone.

Modello di trasporto del calcio intestinale

5. Modello di trasporto del calcio intestinale

La vitamina D è inoltre un importante induttore della maturazione degli osteoblasti, ma è anche promotore della osteoclastogenesi, ossia del differenziamento e dell’attivazione degli osteoclasti. Il rimodellamento osseo è un processo abbastanza complesso dove la massa ossea viene mantenuta grazie a sistemi che accoppiano e tengono in equilibrio la mineralizzazione, favorita dagli osteoblasti, con il processo di riassorbimento,  mediato dagli osteoclasti. Modulando la sintesi e l’attività di fattori di crescita e molecole della comunicazione intercellulare (citochine), la vitamina D è in grado di regolare questo equilibrio e di fare tendere l’osso o verso la formazione o verso il suo depauperamento. Grazie alla sua duplice attività, la vitamina D gioca un ruolo centrale nel rimodellamento del tessuto osseo.

Senza entrare troppo nel dettaglio, gli osteoblasti sono cellule mononucleate, si tratta di fibroblasti che si sono specializzati nella produzione di collagene di tipo I – il principale costituente della matrice organica del tessuto osseo – e nella successiva mineralizzazione per deposizione di ioni Ca2+ e P. Gli osteoclasti sono invece sincizi (ossia cellule con molti nuclei) ricchi di lisosomi, derivano dalla linea mieloide dei monociti-macrofagi ed erodono la matrice ossea mediante acidificazione – grazie all’attività dell’anidrasi carbonica, una liasi che produce bicarbonato (HC) e protoni (H+) a partire da anidride carbonica (CO2) e acqua (H2O) –  e rilascio di enzimi proteolitici, come le catepsine (in particolare, catepsina K) e metalloproteasi (endopeptidasi zinco-dipendenti) della matrice (MMP) che sono in grado di demolire il collagene.

La vitamina D favorisce la mineralizzazione del tessuto osseo grazie al suo effetto antiproliferativo e prodifferenziativo, che esercita direttamente sugli osteoblasti mediante, per esempio, un controllo positivo sull’espressione sia del fattore di crescita trasformante (TGF) che del recettore per TGF. Tuttavia la vitamina D stimola anche il rilascio di Ca2+ dalle ossa poiché agisce, unitamente al paratormone, sulle cellule progenitrici degli osteoblasti (o preosteoblasti), inducendole ad esprimere fattori di crescita e citochine che attivano gli osteoclasti. Gli osteoclasti, infatti, a differenza degli osteoblasti, non esprimono il VDR. La vitamina D promuove in maniera indiretta l’osteoclastogenesi, ad esempio stimolando i preosteoblasti a produrre M-CSF (acronimo di Macrophage Colony-Stimulating Factor), una citochina che interagisce con recettori specifici delle cellule della linea dei monociti-macrofagi e li stimola a differenziare in osteoclasti maturi, oppure mediante l’attivazione del sistema RANKL/RANK/Osteoprotegerina.

RANKL (acronimo di Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand) è una citochina, membro della famiglia dei TNF (Fattori di Necrosi Tumorale); RANK è il recettore di RANKL ed è esposto sulla membrana plasmatica dei precursori degli osteoclasti. L’attivazione del sistema RANK-RANKL stimola l’aggregazione e la maturazione in osteoclasti maturi; osteoprotegerina (OPG) è un recettore decoy solubile, dove per decoy si intende quel recettore in grado di legare lo stesso ligando endogeno (RANKL) del recettore tradizionale (RANK), ma incapace di innescare alcuna risposta cellulare. Quando una citochina, come RANKL, interagisce con il suo recettore, attiva infatti un sistema di trasduzione del segnale, ossia una cascata di fosforilazioni catalizzate da chinasi, che può avere diversi significati per la cellula, sia proliferativi sia differenziativi. Tramite i recettori decoy è possibile attuare un meccanismo di regolazione negativa dell’attività del ligando, poiché questi recettori competono coi recettori tradizionali per RANKL ma, rispetto a questi ultimi, sono privi del dominio per la trasduzione del segnale. La vitamina D, a livello dei preosteoblasti, stimola la produzione di RANKL ed inibisce l’espressione del recettore decoy, OPG. RANKL, interagendo con RANK, innesca sui precursori degli osteoclasti i meccanismi di attivazione, differenziamento, sopravvivenza e adesione cellulare. L’attivazione del recettore decoy riduce o annulla questi effetti. La vitamina D, attivando la produzione di RANKL ed inibendo OPG, favorisce l’osteoclastogenesi ed il riassorbimento osseo. Tuttavia, dopo un po’ la stessa vitamina D stimola, sempre a livello degli osteoblasti, la sintesi di OPG, che riduce la quantità di RANKL disponibile per RANK, bloccando la formazione e l’attivazione degli osteoclasti.

Maturazione degli osteoclasti mediante il sistema RANKL/RANK/OPG

6. Maturazione degli osteoclasti mediante il sistema RANKL/RANK/OPG

Gli effetti della vitamina D sull’omeostasi del calcio e sul metabolismo osseo sono noti già dalla metà dell’800. L’osteomalacia è stata la prima malattia ad essere attribuita al deficit severo (livello sierico <10 ng/mL, i valori normali sono tra 30 e 150 ng/mL) di vitamina D. Essa è caratterizzata da un’alterata mineralizzazione dell’osso. Nei bambini si parla di rachitismo anziché osteomalacia perché l’insufficiente mineralizzazione si verifica prima della saldatura delle ossa. Alcune evidenze hanno dimostrato inoltre che anche l’osteoporosi potrebbe essere associata alla deficienza di vitamina D: il rischio di fratture diminuisce del 20% quando si assume vitamina D per via orale.  L’intossicazione da vitamina D (livello sierico >150 ng/mL) è invece estremamente rara e determina un eccessivo recupero di calcio da intestino, reni e ossa. Pertanto è caratterizzata da aumentato livello di calcio nelle urine (ipercalciuria) e nel sangue (ipercalcemia), con conseguente demineralizzazione ossea, maggiore rischio di fratture, calcoli renali, calcificazione dei tessuti molli. L’intossicazione da vitamina D è causata esclusivamente da assunzione eccessiva di vitamina D, anziché da prolungata esposizione al Sole: l’eccesso di colecalciferolo è infatti distrutto dalla luce solare.

Abbiamo dunque compreso che la vitamina D è tecnicamente un ormone steroideo, capace di regolare l’espressione genica in cellule di paratiroidi, intestino, reni e ossa, per il mantenimento dell’omeostasi del calcio nei fluidi interstiziali e nel sangue. Vedremo comunque che quello della vitamina D è un sistema ormonale ben più complesso di quanto si pensi,  come dimostra il fatto che in certi casi è grado di attivare risposte biologiche tanto rapide da far pensare che la vitamina D non agisca direttamente lei a livello genomico, bensì che attivi, mediante un recettore localizzato sulla membrana plasmatica, un sistema di trasduzione del segnale. Inoltre, troveremo la vitamina D coinvolta nella proliferazione e nel differenziamento di tipi cellulari di numerosi altri tessuti, in condizioni sia fisiologiche sia patologiche. Tutto questo, alla prossima!

 

 



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